耗氧量測量

在37°C的密閉室中使用安培電極(Unisense)測量耗氧量。2×105個(gè)細(xì)胞用0.03毫克/毫升的洋地黃皂苷進(jìn)行透化處理。測量在含有137 mM NaCl、5 mM KCl、0.7 mM K2 HPO4和25 mM Tris-HCl pH 7.4的培養(yǎng)基中進(jìn)行。加入10 mM丙酮酸和5 mM蘋果酸，以刺激由復(fù)合物I、III和IV組成的通路。加入20毫摩爾琥珀酸以刺激由復(fù)合物II、III和IV形成的途徑。0.1 mM的魚藤酮或50μM的抗霉素A(復(fù)合物I或復(fù)合物III的特異性抑制劑)分別用于阻斷第一條和第二條途徑。

生物發(fā)光熒光素酶ATP測定

為了評估通過Fo-F1 ATP合成酶合成ATP的情況，將2×105個(gè)細(xì)胞在37°C培養(yǎng)基中培養(yǎng)10分鐘，培養(yǎng)基中含有：10 mM Tris-HCl(pH 7.4)、100 mM KCl、5 mM KH2PO4、1 mM EGTA、2.5 mM EDTA和5 mM MgCl2、0.6 mM ouabain和25 mg/ml氨芐青霉素。然后，加入10毫摩爾丙酮酸加5毫摩爾蘋果酸或20毫摩爾琥珀酸，分別刺激由復(fù)合物I、III和IV或復(fù)合物II、III和IV組成的通路，誘導(dǎo)ATP合成。使用10-8和10-5 M之間的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過熒光素/熒光素酶化學(xué)發(fā)光法(試劑盒)，在熒光計(jì)中每隔30秒監(jiān)測反應(yīng)兩分鐘。數(shù)據(jù)以nmol ATP生成/分鐘/106個(gè)細(xì)胞表示。

ATP和AMP水平的評估

根據(jù)酶偶聯(lián)法，在340納米波長處進(jìn)行NAD(P)/NAD(P)H還原/氧化后，測量ATP和AMP。ATP定量測定在含有以下成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行：100 mM Tris-HCl，pH 7.4，5 mM MgCl2，50 mM葡萄糖，0.2 mM NADP。加入4μg純化的己糖激酶和2μg葡萄糖-6-磷酸脫氫酶后開始檢測。

使用以下培養(yǎng)基檢測AMP濃度：100 mM Tris-HCl，pH 7.4，5 mM MgCl2，10 mM磷酸烯醇丙酮酸，0.15 mM NADH，0.2 mM ATP。在加入4μg純化丙酮酸激酶加乳酸脫氫酶和2μg腺苷酸激酶后，開始進(jìn)行測定。

乳酸釋放的評估

在NAD+還原后，測量生長培養(yǎng)基中的乳酸濃度。測定混合物包括100mM Tris-HCl pH 7.4、5mM NAD+和4IU乳酸脫氫酶。數(shù)據(jù)以細(xì)胞數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)。

線粒體膜電位的評估

為了評估不同腫瘤細(xì)胞系的線粒體膜電位，在生長培養(yǎng)基中加入250 nM的Mitotracker 633(MT633)，在平板讀取器中每10分鐘監(jiān)測一次熒光，持續(xù)60分鐘，分別使用644 nM和665 nM作為激發(fā)波長和發(fā)射波長。

糖酵解酶測定

酶活性以IU/mg(微摩爾/分鐘/mg蛋白質(zhì))表示。測定以50μg總蛋白為基礎(chǔ)。用于測定每種酶活性的反應(yīng)混合物的制備方法如下。己糖激酶(HK，EC 2.7.1.1)：100 mM Tris-HCl pH 7.4、5 mM MgCl2、200 mM葡萄糖、1 mM ATP、0.91 mM NADP和0.55 IU/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)。磷酸果糖激酶(PFK，EC 2.7.1.11)：100 mM Tris-HCl pH 7.4、2 mM MgCl2、5 mM KCl、2 mM 6磷酸果糖、1 mM ATP、0.5 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、0.2 mM NADH和2 IU/ml丙酮酸激酶加乳酸脫氫酶。丙酮酸激酶(PK，EC 2.7.1.40)：100 mM Tris-HCl pH 7.6、2.5 mM MgCl2、10 mM KCl、0.6 mM磷酸烯醇丙酮酸、0.2 mM NADH、5 mM ADP和1 IU/ml乳酸脫氫酶。乳酸脫氫酶(LDH，EC 1.1.1.27)：100 mM Tris-HCl pH 9、5 mM丙酮酸和0.2 mM NADH。

過氧化氫酶活性測定

消耗5mM H2O2后，用分光光度法評估50μg總蛋白質(zhì)的過氧化氫酶活性。酶活性以IU/mg(微摩爾/分鐘/mg蛋白質(zhì))表示。

丙二醛的評估

為了評估脂質(zhì)過氧化，使用硫代巴比妥酸活性物質(zhì)(TBARS)測定法評估丙二醛(MDA)濃度。TBARS溶液包含15%三氯乙酸(TCA)和0.25 N HCl以及26mM硫代巴比妥酸。

為了評估MDA的基礎(chǔ)濃度，將600μl的TBARS溶液加入溶解在300μl毫升水的50μg總蛋白質(zhì)中?；旌弦涸?00°C下培養(yǎng)40分鐘。然后，樣品在14,000 rpm轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，上清液在532納米波長下進(jìn)行分光光度分析。

Western blot分析

蛋白質(zhì)裂解物的制備方法如前所述。蛋白質(zhì)裂解液在十二烷基硫酸鈉-10%或14%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用兔mAb抗磷酸-AMPKα(Thr172)(克隆40H9)、兔mAb抗LAMP1(克隆C54H11)和過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔抗體作為二抗進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)制造商的說明，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)對免疫復(fù)合物進(jìn)行顯色。

小鼠體內(nèi)治療研究

在六周大的雌性裸鼠右腹部皮下注射1×105個(gè)B16小鼠黑色素瘤腫瘤細(xì)胞。小鼠被隨機(jī)分配接受每公斤體重30毫克的姜黃素或僅接受載體(對照組小鼠)。當(dāng)小鼠可觸及腫瘤(腫瘤直徑約2毫米)時(shí)，將溶解的姜黃素或單獨(dú)的載體注射到小鼠尾靜脈，連續(xù)十天。腫瘤體積用卡尺測量，計(jì)算公式如下：腫瘤體積(立方毫米)=(長×寬×高，單位：毫米)×π/6。每天記錄小鼠的體重和一般身體狀況，當(dāng)小鼠出現(xiàn)健康狀況不良的跡象時(shí)，用甲苯噻嗪麻醉后頸椎脫臼處死。

免疫熒光分析及微血管密度和血管大小的量化

治療結(jié)束后對皮下腫瘤進(jìn)行組織學(xué)評估。簡而言之，將腫瘤樣本固定在10%的緩沖福爾馬林溶液中，并用石蠟包埋。為了進(jìn)行免疫熒光分析，從石蠟塊上切下4微米厚的切片，用識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞的單克隆抗體染色，即抗CD34和α平滑肌肌動(dòng)蛋白。然后用FITC結(jié)合的山羊抗兔和抗鼠(Abcam)二抗培養(yǎng)載玻片。所有抗體染色實(shí)驗(yàn)均使用同型匹配的非結(jié)合mAbs，以排除非特異性反應(yīng)。用磷酸鹽緩沖生理鹽水清洗玻片后，用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行反染色，然后蓋上玻片。使用尼康E-1000熒光顯微鏡和Genikon成像系統(tǒng)軟件采集數(shù)字圖像。從兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)抽取15個(gè)視野，量化CD34和αSMA陽性細(xì)胞的百分比。

結(jié)果

姜黃素通過抑制ATP合成酶的活性，降低體外和體內(nèi)ATP的生成和耗氧量，從而誘發(fā)致命的能量損傷

鑒于之前有跡象表明姜黃素能抑制原核生物ATP合成酶的活性，我們研究了這種多酚對來自不同組織的一系列小鼠癌細(xì)胞的影響。我們通過熒光測定法分析了小鼠B16黑色素瘤、CT26結(jié)腸癌、4T1乳腺癌細(xì)胞和L1210淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞分離的線粒體膜中ATP合成酶的活性。我們觀察到所有細(xì)胞系的ATP合成酶活性都明顯降低。在B16、CT26、L1210和4T1細(xì)胞中，ATP合成酶活性分別降低了46%、36%、64%和30%(圖1A)。在B16、CT26、L1210和4T1細(xì)胞中，ATP合成酶活性的抑制與ATP生成量分別減少32%、18%、35%和46%有關(guān)。除CT26以外，其他細(xì)胞系A(chǔ)TP生成量顯著減少(圖1B)。

在B16、CT26、L1210和4T1細(xì)胞中，ATP/AMP比值(細(xì)胞整體能量電荷的綜合指標(biāo))分別顯著降低了23%、61%、21%和36%(圖1C)。由于抑制了ATP合成酶，姜黃素在所有細(xì)胞系中都導(dǎo)致質(zhì)子積累引起膜電位顯著升高(補(bǔ)充圖1)。

在丙酮酸/蘋果酸(圖1D)和琥珀酸(圖1E)存在的情況下，用氧微量呼吸電極測量，細(xì)胞的耗氧量也隨之急劇下降。

我們還測試了姜黃素對ATP合成的影響是否可以通過抑制NFκB來模擬。為此，我們使用了IkKβ特異性競爭抑制劑SC-514，因?yàn)橛袌?bào)道稱姜黃素可作用于該激酶。圖1F顯示，聯(lián)合添加SC-514和姜黃素4小時(shí)和24小時(shí)后，SC-514對B16細(xì)胞的ATP合成沒有影響。與之前觀察到的一樣，與姜黃素同時(shí)處理的B16細(xì)胞ATP合成減少(圖1F)。與單用姜黃素處理的細(xì)胞相比，SC-514與姜黃素的組合沒有產(chǎn)生任何疊加效應(yīng)(圖1F)。不過，姜黃素和SC-514都能顯著抑制Bcl2的表達(dá)，Bcl2是一種抗凋亡基因，其轉(zhuǎn)錄受NFκB控制，但兩者的動(dòng)力學(xué)過程顯然不同(圖1G)。姜黃素和SC-514的組合沒有顯示出任何相加效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明，姜黃素對NFκB和ATP合酶都有抑制作用，但對后者的活性并不取決于對前者的活性。

我們研究了在體內(nèi)是否可以觀察到的所有四種細(xì)胞系對ATP合酶活性的抑制。我們在免疫缺陷小鼠皮下注射B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞。當(dāng)可觸及腫瘤(腫瘤直徑約2 mm)時(shí)，每隔一天向尾靜脈注射溶解的姜黃素(30 mg/kg)或單獨(dú)的姜黃素，連續(xù)10天，用卡尺測量腫瘤體積。姜黃素處理小鼠的腫瘤生長明顯低于對照處理小鼠(圖2A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，切除腫瘤，制備線粒體膜組分，分析ATP合成及ATP和AMP含量。與對照組小鼠相比，姜黃素處理動(dòng)物腫瘤中ATP合酶活性、ATP濃度和ATP/AMP比值顯著降低(圖2B)，表明姜黃素在體內(nèi)也能抑制ATP合酶。