EPR Spin-Trapping for Monitoring Temporal Dynamics of Singlet Oxygen during Photoprotection in Photosynthesis  

EPR自旋捕獲技術(shù)用于監(jiān)測(cè)光合作用光保護(hù)過程中單線態(tài)氧的時(shí)間動(dòng)態(tài)  

來源：Biochemistry 2024, 63, 1214-1224  

《生物化學(xué)》2024年第63卷第1214-1224頁(yè)  

 

摘要內(nèi)容：  

摘要提出了一種結(jié)合電子順磁共振（EPR）自旋捕獲和時(shí)間分辨熒光光譜的方法，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物類囊體膜在光保護(hù)過程中單線態(tài)氧（1O?）的動(dòng)態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)光照1小時(shí)期間，1O?的表觀濃度先下降后上升。光照初期，1O?濃度的下降與非光化學(xué)淬滅（NPQ）激活導(dǎo)致的葉綠素?zé)晒鈮勖s短同步；而使用跨膜質(zhì)子梯度解偶聯(lián)劑尼日利亞菌素（nigericin）會(huì)延遲NPQ和1O?的調(diào)節(jié)。NPQ飽和后，無論是否處理，1O?*濃度均上升，表明NPQ在短期內(nèi)（前10分鐘）通過耗散過剩能量減輕光氧化壓力。  

 

研究目的：  

明確光合作用光保護(hù)過程中單線態(tài)氧（1O?）的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制，驗(yàn)證NPQ（非光化學(xué)淬滅）對(duì)1O?產(chǎn)生的抑制作用，并開發(fā)一種能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)復(fù)雜生物系統(tǒng)中1O?*濃度變化的方法。  

 

研究思路：  

方法優(yōu)化：先在染料系統(tǒng)（如玫瑰紅RB和甲苯胺藍(lán)TB）中驗(yàn)證EPR自旋捕獲技術(shù)檢測(cè)1O?*的可行性（圖1B, 1C）。  

 

 

生物應(yīng)用：將優(yōu)化后的EPR方法應(yīng)用于植物類囊體膜，結(jié)合時(shí)間分辨熒光光譜測(cè)量葉綠素?zé)晒鈮勖▓D6A-C），分析NPQ與1O?*的時(shí)間相關(guān)性。  

 

 

條件調(diào)控：通過添加解偶聯(lián)劑（nigericin）破壞跨膜質(zhì)子梯度，研究其對(duì)NPQ和1O?*動(dòng)態(tài)的影響（圖5C, 6E-F）。  

 

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及意義（標(biāo)注對(duì)應(yīng)圖表）：  

EPR信號(hào)動(dòng)力學(xué)（圖2A, 3B, 4）：通過監(jiān)測(cè)TEMPO自由基的生成和衰減，量化1O?*濃度變化，驗(yàn)證光照強(qiáng)度和氧氣濃度對(duì)光敏化反應(yīng)的影響。  

 

 

 

 

熒光壽命數(shù)據(jù)（圖6A-C）：測(cè)量葉綠素?zé)晒鈮勖兓?，反映NPQ的激活程度（NPQ值計(jì)算為（τ_dark?τ(t)）/τ(t)）。  

氧氣釋放數(shù)據(jù)：使用丹麥Unisense電極（Oxy-NP探針）驗(yàn)證類囊體膜的放氧活性，確保實(shí)驗(yàn)體系的生理相關(guān)性。  

 

研究結(jié)論：  

NPQ在光照初期通過縮短葉綠素激發(fā)態(tài)壽命顯著減少1O?*生成（前10分鐘）。  

長(zhǎng)時(shí)間光照后（>15分鐘），抗氧化系統(tǒng)飽和導(dǎo)致1O?*濃度回升，表明NPQ的短期保護(hù)作用。  

跨膜質(zhì)子梯度（ΔpH）是NPQ激活的關(guān)鍵因素，解偶聯(lián)劑nigericin延遲了NPQ和1O?*的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。  

 

丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀：  

使用Unisense Oxy-NP探針測(cè)量了類囊體膜的氧氣釋放活性，驗(yàn)證了分離膜的生理功能完整性。該數(shù)據(jù)確認(rèn)了類囊體在實(shí)驗(yàn)條件下仍保持光驅(qū)動(dòng)的水分解能力（即光系統(tǒng)II活性），排除了樣本制備過程中可能導(dǎo)致的膜損傷對(duì)后續(xù)結(jié)果的干擾。這一測(cè)量為后續(xù)EPR和熒光實(shí)驗(yàn)提供了生物學(xué)有效性支持，確保觀測(cè)到的1O?*動(dòng)態(tài)變化真實(shí)反映光合膜的自然響應(yīng)，而非人工假象。