Dynamic in situ detection in iRhizo-Chip reveals diurnal fluctuations of Bacillus subtilis in the rhizosphere

iRhizo-Chip 中的動(dòng)態(tài)原位檢測揭示了根際枯草芽孢桿菌的晝夜波動(dòng)

來源：PNAS 2024 Vol. 121 No. 40 e2408711121

 

1. 摘要核心內(nèi)容

 

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：

通過自主研發(fā)的微流控平臺(tái)iRhizo-Chip，首次實(shí)現(xiàn)了水稻根際環(huán)境中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生長的原位動(dòng)態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)其豐度存在顯著的晝夜波動(dòng)（白天增長至5,000–10,000 cells/mL，夜間降至2,000–3,000 cells/mL）。

驅(qū)動(dòng)機(jī)制：

這種波動(dòng)主要由根際溶解氧（DO）和pH的晝夜變化驅(qū)動(dòng)（DO白天↑45%、夜間↓30%；pH白天↑5.3、夜間↓4.9），并通過體外控制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖5B, C）。

技術(shù)價(jià)值：

iRhizo-Chip 兼容多種原位檢測技術(shù)（如熒光成像、平面光極），為研究根際多因子耦合過程提供了高時(shí)空分辨率工具。

 

 

2. 研究目的

 

核心問題：

解決傳統(tǒng)方法無法在自然土壤環(huán)境中實(shí)時(shí)監(jiān)測微生物動(dòng)態(tài)的局限，探究枯草芽孢桿菌在根際的時(shí)空分布規(guī)律及其與環(huán)境因子的互作機(jī)制。

應(yīng)用目標(biāo)：

為優(yōu)化益生菌定殖策略、提升生物防治效率提供理論依據(jù)，推動(dòng)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展。

 

3. 研究思路

 

平臺(tái)開發(fā)：

設(shè)計(jì)iRhizo-Chip微流控裝置（圖1A-E），保留原位根際土壤（圖1F），集成熒光探針、平面光極（PO）等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)同步監(jiān)測。

 

動(dòng)態(tài)監(jiān)測：

使用GFP標(biāo)記枯草芽孢桿菌，通過流式細(xì)胞術(shù)（圖1G）和共聚焦顯微鏡（圖2C）定量其晝夜豐度變化及空間分布（圖2A-B）。

 

原位測量根際DO、pH、ROS（活性氧）、DOC（溶解性有機(jī)碳）的時(shí)空動(dòng)態(tài)（圖3A）。

機(jī)制驗(yàn)證：

通過線性回歸分析環(huán)境因子與菌群生長的相關(guān)性（圖3B）。

體外控制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DO、pH、DOC、ROS對(duì)菌生長的獨(dú)立影響（圖5B-E）。

 

 

4. 測量數(shù)據(jù)及研究意義

關(guān)鍵數(shù)據(jù)來源與意義

測量指標(biāo) 數(shù)據(jù)來源 研究意義

枯草芽孢桿菌豐度 流式細(xì)胞術(shù)（圖1G）

熒光成像（圖2C） 揭示菌群晝夜波動(dòng)規(guī)律，證明根際微生物動(dòng)態(tài)與植物生理節(jié)律同步。

DO/pH時(shí)空分布 平面光極（PO）（圖4A）

Unisense微電極（附錄圖S4） 闡明環(huán)境因子的空間異質(zhì)性（根尖DO/pH變化最顯著），驗(yàn)證iRhizo-Chip數(shù)據(jù)可靠性。

ROS/DOC動(dòng)態(tài) 熒光探針（H?DCFDA）（圖3A）

TOC分析儀 發(fā)現(xiàn)ROS與DO正相關(guān)（光照期↑）、DOC與菌生長負(fù)相關(guān)（夜間↑），揭示碳代謝與氧化應(yīng)激的耦合作用。

菌群空間定殖模式 共聚焦成像（圖2A-B）

附錄圖S7 顯示菌群在根尖和伸長區(qū)富集，為根分泌物驅(qū)動(dòng)的趨化行為提供證據(jù)。

 

5. 核心結(jié)論

 

晝夜波動(dòng)機(jī)制：

枯草芽孢桿菌的生長受根際DO和pH晝夜振蕩直接驅(qū)動(dòng)（圖5A）：

DO↑（光照期）→ 促進(jìn)好氧生長（圖5B）；

pH↑（5.3 vs 4.9）→ 顯著提升菌增殖速率（圖5C）。

次要因素作用：

DOC↑促進(jìn)生長但根際夜間DOC積累與菌豐度負(fù)相關(guān)（圖3B, 5D），暗示碳源競爭或代謝抑制；

高濃度ROS抑制生長（圖5E），但生理范圍內(nèi)的ROS波動(dòng)與菌豐度正相關(guān)。

技術(shù)突破：

iRhizo-Chip 首次實(shí)現(xiàn)自然根際土壤環(huán)境下的多參數(shù)原位聯(lián)測，為研究微生物-植物-環(huán)境互作提供了范式工具。

 

6. 丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

數(shù)據(jù)來源與方法

 

測量目標(biāo)：

使用Unisense OXY25（DO）和pH-N微電極（丹麥Unisense公司），在自然土壤中每30分鐘監(jiān)測根際DO/pH動(dòng)態(tài)（附錄圖S4），與iRhizo-Chip內(nèi)PO數(shù)據(jù)對(duì)比。

對(duì)照設(shè)計(jì)：

將芯片內(nèi)PO數(shù)據(jù)（圖3A, 4A）與Unisense微電極的自然土壤數(shù)據(jù)同步分析，驗(yàn)證芯片模擬環(huán)境的真實(shí)性。

 

研究意義

 

驗(yàn)證平臺(tái)可靠性：

Unisense電極作為土壤原位檢測金標(biāo)準(zhǔn)，其數(shù)據(jù)與iRhizo-Chip的PO結(jié)果高度一致（附錄圖S4），證明iRhizo-Chip能準(zhǔn)確模擬自然根際的DO/pH晝夜波動(dòng)（如DO光照期↑15%），消除了微流控體系"脫離真實(shí)環(huán)境"的質(zhì)疑。

揭示生態(tài)關(guān)聯(lián)性：

Unisense數(shù)據(jù)證實(shí)自然根際存在強(qiáng)氧化-還原梯度（根尖DO最高，徑向遞減），與iRhizo-Chip中菌群的空間分布吻合（圖4B）；

二者協(xié)同證明：植物光合節(jié)律（光照→根系釋氧→DO↑/pH↑）是驅(qū)動(dòng)微生物晝夜動(dòng)態(tài)的核心生態(tài)鏈路。

技術(shù)互補(bǔ)性：

微電極提供點(diǎn)尺度高精度數(shù)據(jù)，而iRhizo-Chip實(shí)現(xiàn)二維時(shí)空成像，二者結(jié)合為根際多尺度過程研究提供完整方案。

 

總結(jié)

 

該研究通過創(chuàng)新性平臺(tái)iRhizo-Chip，首次揭示了枯草芽孢桿菌在根際的晝夜生長波動(dòng)受DO/pH直接調(diào)控，并利用Unisense微電極驗(yàn)證了人工芯片與自然土壤環(huán)境的一致性。這一發(fā)現(xiàn)深化了對(duì)根際微生態(tài)時(shí)間動(dòng)態(tài)的理解，為設(shè)計(jì)"時(shí)間精準(zhǔn)"的微生物接種策略（如白天施用益生菌）提供了理論支撐，同時(shí)推動(dòng)了原位檢測技術(shù)在土壤生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用邊界。