摘要：該文以沙冬青、綠豆為材料，利用微電極技術(shù)實(shí)時(shí)記錄了活體沙冬青和綠豆根冠細(xì)胞膜電位對(duì)不同鹽分的原初響應(yīng)，分析了質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑(Vanadate、TEA)對(duì)植物根冠細(xì)胞膜電位的影響。結(jié)果表明：50、100、200mmol／LNaC1、KC1和LiC1均會(huì)引起植物細(xì)胞膜電位去極化。對(duì)于同一陽(yáng)離子而言，去極化程度隨處理液中離子濃度的增加而加強(qiáng)；對(duì)于同一濃度、不同陽(yáng)離子而言，由于水合離子半徑大小不一(K<Na<Li)，在根自由空間的遷移速率不同(K>Na>Li)，因此引起膜電位的去極化程度也存在差異(K>Na>Li)；同一陽(yáng)離子且同一濃度下對(duì)于不同植物來(lái)說(shuō)，綠豆根冠細(xì)胞膜電位去極化程度大于沙冬青，即單位時(shí)間綠豆根對(duì)Na的通透性大于沙冬青。質(zhì)膜H一ATPase和K通道參與了沙冬青和綠豆在鹽脅迫時(shí)的原初響應(yīng)，K通道可能參與了Na的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

植物抵抗環(huán)境脅迫的能力取決于植物感知脅迫和激活防御響應(yīng)的效率?。植物通過(guò)根細(xì)胞質(zhì)膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成對(duì)根系附近K、Na等的選擇性吸收。質(zhì)膜上與離子轉(zhuǎn)運(yùn)及抗鹽性有關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要有3類(lèi)：泵、載體和離子通道。其中離子通道的開(kāi)閉與細(xì)胞質(zhì)膜的極化和去極化程度有直接關(guān)系。Yao等的研究表明，NaC1會(huì)引起植物細(xì)胞膜電位去極化；安國(guó)勇等認(rèn)為小麥(Triticumaestivum)根細(xì)胞膜電位變化可調(diào)控質(zhì)膜K通道開(kāi)閉，100mmol／LNaC1引起小麥根細(xì)胞膜電位去極化，并伴隨著細(xì)胞內(nèi)K含量降低，而10 mmol／L CaC1可以穩(wěn)定細(xì)胞膜電位，抑制NaC1引起的膜電位變化，從而促進(jìn)小麥根對(duì)K的積累。前人對(duì)植物細(xì)胞跨膜電位的研究，多集中于小麥、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等作物在養(yǎng)分吸收過(guò)程中養(yǎng)分離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方面。對(duì)于木本植物在鹽脅迫下，細(xì)胞膜電位的實(shí)時(shí)瞬態(tài)變化特征尚無(wú)報(bào)道。沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)屬于豆科(Leguminosae)、沙冬青屬(Ammopiptanthus)，是珍稀瀕危和重點(diǎn)保護(hù)植物，也是我國(guó)荒漠中唯一的常綠闊葉灌木。在沙漠生長(zhǎng)的植物中有活化石之稱(chēng)。以往由于試驗(yàn)技術(shù)等原因，對(duì)活體沙冬青遭受鹽脅迫時(shí)的實(shí)時(shí)瞬態(tài)響應(yīng)研究甚少。本實(shí)驗(yàn)利用微電極實(shí)時(shí)記錄了耐鹽性強(qiáng)的沙冬青和耐鹽性弱的綠豆(PhaseolusradiatusL．)在鹽脅迫條件下細(xì)胞膜電位(plasmamembranepotentia1)的原初響應(yīng)特征，在膜水平上探討植物的耐鹽機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明，微電極測(cè)定膜電位，方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高，不僅為研究植物對(duì)鹽脅迫的快速響應(yīng)提供一種新的方法，而且能夠?yàn)檫M(jìn)一步揭示植物感知鹽脅迫及忍耐鹽脅迫的機(jī)制提供重要參考。

1材料與方法

1．1材料培養(yǎng)與處理

選取大小均勻、飽滿的沙冬青和綠豆種子，先用70％乙醇表面消毒10min，再用10％的NaC10處理25min后，放入墊有濾紙且已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中，加人材料培養(yǎng)液(表1)，用封口膜封好(以上操作均在無(wú)菌條件下完成)。于25℃恒溫、黑暗人工氣候箱(HPG一280H)中生長(zhǎng)。待幼根長(zhǎng)至0．5am左右時(shí)，挑選長(zhǎng)短一致的沙冬青和綠豆幼苗，分別放入裝有空白測(cè)定液(表1)的測(cè)試槽中，靜置平衡后測(cè)定幼根根冠區(qū)(距根尖400肚m處)細(xì)胞膜電位。不同處理的測(cè)定液(如100mmol／LNaC1、KC1)是通過(guò)直接加入一定濃度的相應(yīng)化學(xué)物質(zhì)的母液至空白測(cè)定液中經(jīng)擴(kuò)散后而得到。

微電極制作實(shí)驗(yàn)用微電極選擇內(nèi)徑為0．9mm、外徑為1．5mm的硼硅酸有芯玻璃毛細(xì)管，在拉制儀(NarishigePP一830，Japan)上采用兩步法拉制而成。制成的微電極尖端直徑約為0．5～1 m，微電極灌充液為100mmol／LKC1。參考電極為Ag／AgC1。

1．3膜片鉗系統(tǒng)測(cè)定根冠細(xì)胞膜電位

1．3．1靜息膜電位測(cè)定

選擇健康幼根固定在透明玻璃槽內(nèi)，加5mL空白測(cè)定液，靜置平衡10min，接通電路，在OlympusIX71倒置顯微鏡下借助顯微操縱器(MP-285)輕輕將微電極(測(cè)量電極)刺入待測(cè)幼根根冠區(qū)(距根尖400p．m處)細(xì)胞。微電極另一端連接Axon公司的Multiclamp700B放大器和Digidata 1322A數(shù)模轉(zhuǎn)換器，完成細(xì)胞膜電位信號(hào)的放大、采集和轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析用Clampex9．2軟件。靜息膜電位測(cè)定分別用不同幼根重復(fù)l0次。

1．3．2不同處理下膜電位測(cè)定

當(dāng)幼根在空白測(cè)定液中的靜息膜電位平穩(wěn)后，改變測(cè)定液成分實(shí)時(shí)記錄幼根根冠細(xì)胞膜電位隨外界環(huán)境變化而發(fā)生的原初響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)比較了50、100、200mmol／L一價(jià)陽(yáng)離子氯鹽NaC1、KC1和LiC1對(duì)沙冬青和綠豆根冠細(xì)胞膜電位的影響。

另外，利用質(zhì)膜H一ATPase活性專(zhuān)一抑制劑——釩酸鹽(Vanadate)、質(zhì)膜K通道抑制劑TEA分析活體植物根冠細(xì)胞膜電位與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的關(guān)系。在放有沙冬青和綠豆的空白測(cè)定液中先加入1mmol／LVanadate或10mmol／LTEA平衡10min后，進(jìn)行膜電位測(cè)定。當(dāng)靜息膜電位平穩(wěn)后加入100mmol／LNaC1處理，實(shí)時(shí)記錄膜電位變化趨勢(shì)。以空白測(cè)定液中直接加入100mmol／LNaC1時(shí)沙冬青和綠豆根冠細(xì)胞膜電位的變化為對(duì)照。