圖2、MoDCs直接與共培養(yǎng)的胃球上皮細(xì)胞結(jié)合。將細(xì)胞追蹤器標(biāo)記的MoDCs加入表達(dá)mCherry的胃球形細(xì)胞培養(yǎng)物中。48小時(shí)后，在Leica SP5激光共聚焦掃描顯微鏡上使用63×水浸物鏡對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行固定和成像。(A-C)遷移到胃上皮球體(紅色)基外側(cè)的細(xì)胞追蹤DeepRed標(biāo)記MoDCs(藍(lán)色)。比例尺：50μm。(A)XY圖像，57個(gè)單獨(dú)圖像的最大Z投影，步長(zhǎng)為1μm。(B)同一球體的XZ投影。(C)單張XY切片顯示了直流電(箭頭)與球面之間的物理聯(lián)系。(D)6個(gè)相鄰切片的Z向投影顯示胃球表面廣泛的樹(shù)突形成。(E)高分辨率圖像顯示，CellTracker DeepRed標(biāo)記的MoDCs(藍(lán)色)與胃上皮細(xì)胞(箭頭)直接接觸，1個(gè)MoDC內(nèi)含mCherry+胃上皮細(xì)胞物質(zhì)(合并圖像中為粉紅色；箭頭)。(F)細(xì)胞追蹤綠標(biāo)記的MoDC(綠色)將樹(shù)突(箭頭)延伸至上皮細(xì)胞層(紅色)。

圖3、幽門(mén)螺桿菌感染人胃上皮細(xì)胞球?qū)е翫C募集增加。(A)從單獨(dú)的Matrigel或幽門(mén)螺桿菌感染的胃球形培養(yǎng)物(20-50個(gè)/培養(yǎng)物)(有或沒(méi)有共培養(yǎng)的MoDCs)中回收細(xì)菌。(B)微電極分析胃球體內(nèi)測(cè)得的管腔氧濃度(n=5或6個(gè)有機(jī)體，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。虛線(xiàn)表示緩沖液中的氧氣濃度。(C)未感染和感染GFP-幽門(mén)螺桿菌(綠色)、表達(dá)mCherry的胃球形體(紅色)與CellTracker標(biāo)記的MoDCs(藍(lán)色)共培養(yǎng)48小時(shí)的代表性共聚焦圖像(單個(gè)光學(xué)切片)。(E)對(duì)3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中8個(gè)未感染和9個(gè)感染了GFP-幽門(mén)螺桿菌的球狀體共培養(yǎng)物的數(shù)字圖像分析。圖中顯示了單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值±SD。(F)將胃上皮球形細(xì)胞復(fù)制為單層細(xì)胞，并用幽門(mén)螺桿菌60190野生型(wt，5×107個(gè)/孔)或一系列TLR激動(dòng)劑(見(jiàn)“材料與方法”部分)處理6小時(shí)。(G)胃球體微注射單獨(dú)的FITC右旋糖酐(分子量4千道爾頓，示蹤劑)或含有幽門(mén)螺桿菌60190野生型、幽門(mén)螺桿菌60190ΔCagA或沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白(1μg/ml)的FITC右旋糖酐。

圖4、幽門(mén)螺桿菌感染會(huì)增加人胃上皮細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，導(dǎo)致直流電募集增強(qiáng)。(A)在Transwell趨化試驗(yàn)中，檢測(cè)從已建立的球形培養(yǎng)物中收集48小時(shí)以上的培養(yǎng)上清(S/Ns)吸引MoDCs(2×105個(gè)/孔)的能力。(B)從感染或未感染幽門(mén)螺桿菌的胃小球中收集的培養(yǎng)上清液在小球顯微注射48小時(shí)后與MoDCs(1×105個(gè)/孔)一起在Transwell趨化試驗(yàn)中進(jìn)行分析。(C)分析了MoDC在存在或不存在百日咳毒素(PTX，10μg/mL)的情況下對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)基或胃球上清的趨化性。圖中顯示的是一式三孔的平均值±SD，3個(gè)實(shí)驗(yàn)中有1個(gè)具有代表性。(D)利用趨化因子陣列分析從感染幽門(mén)螺桿菌和未感染幽門(mén)螺桿菌(48小時(shí))的球形培養(yǎng)物中收集的上清液中是否存在趨化因子。(E)幽門(mén)螺桿菌感染球體與非感染球體中部分趨化因子和細(xì)胞因子基因的相對(duì)基因表達(dá)。(F)48小時(shí)后，收集胃球微注射肉湯、幽門(mén)螺桿菌野生型(wt)、幽門(mén)螺桿菌ΔCagA或沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白的培養(yǎng)上清。(G)用趨化因子陣列分析不同處理的球形培養(yǎng)物上清液中是否存在趨化因子。

圖5、MoDCs對(duì)胃上皮釋放的多種趨化因子具有趨化活性。Transwell趨化試驗(yàn)分析了MoDCs對(duì)不同濃度的(A)CXCL5、(B)CXCL17、(C)CCL20、(D)CXCL8、(E)CXCL16和(F)CXCL1的趨化活性。圖中顯示了3個(gè)或更多實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。一式三孔的平均值±SD，采用單因素方差分析。

結(jié)論與展望

本研究通過(guò)新型胃球共培養(yǎng)模型揭示了胃上皮細(xì)胞在幽門(mén)螺桿菌感染下通過(guò)趨化因子依賴(lài)性機(jī)制主動(dòng)募集樹(shù)突狀細(xì)胞的現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解胃黏膜免疫反應(yīng)提供了新的視角，還為開(kāi)發(fā)針對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的新型免疫治療策略提供了理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了胃上皮細(xì)胞在免疫監(jiān)視中的重要作用，并為研究其他胃腸道病原體與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供了新的思路。本研究的創(chuàng)新之處在于開(kāi)發(fā)了一種能夠模擬胃黏膜生理環(huán)境的共培養(yǎng)模型，該模型不僅允許免疫細(xì)胞與胃上皮細(xì)胞的直接相互作用，還能夠支持幽門(mén)螺桿菌的長(zhǎng)期感染。這一模型為研究胃黏膜免疫反應(yīng)提供了新的工具，并為理解幽門(mén)螺桿菌感染的免疫機(jī)制提供了新的視角。研究結(jié)果表明，胃上皮細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)和感染狀態(tài)下均能夠通過(guò)分泌趨化因子主動(dòng)募集DCs，這一過(guò)程在幽門(mén)螺桿菌感染時(shí)顯著增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)針對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的新型免疫治療策略提供了理論基礎(chǔ)，并為研究其他胃腸道病原體與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供了參考。

unisense微電極通過(guò)精確測(cè)量胃球體內(nèi)的氧濃度，幫助研究人員模擬了幽門(mén)螺桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境，驗(yàn)證了胃球體模型的生理相關(guān)性，并為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了重要依據(jù)。通過(guò)Unisense微電極測(cè)量數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)胃球體內(nèi)的腔隙氧濃度顯著低于周?chē)h(huán)境（如Matrigel基質(zhì)），這種低氧環(huán)境可能有助于幽門(mén)螺桿菌的生存和繁殖。這一發(fā)現(xiàn)解釋了為什么幽門(mén)螺桿菌能夠在胃球體內(nèi)部持續(xù)存活，而直接注入Matrigel中的細(xì)菌則無(wú)法存活。這一技術(shù)的應(yīng)用不僅增強(qiáng)了研究的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，還為理解幽門(mén)螺桿菌感染的機(jī)制提供了新的視角。