圖2、氧化亞氮微電極系統(tǒng)的工作流程示意圖。（A）建立Unisense 氧化亞氮微電極。（B）氧化亞氮微電極系統(tǒng)的啟動，包括預(yù)激活、極化、使用N2O標準溶液進行校準，并構(gòu)建線性回歸以計算每個實驗的樣品濃度。（C）樣品測量需要10 min，其中前5 min用于平衡，后5 min的信號取平均值以獲得數(shù)據(jù)。（D）每次使用10次連續(xù)稀釋濃度的N2O標準溶液和0μM的水構(gòu)建線性回歸。對于低于0.1μM的濃度（根據(jù)制造商的說明的最低檢測限），將處理為0μM。

圖3、定量慢生根瘤菌屬產(chǎn)生的N2O伴/不伴Calonectria ilicicola。（A）在提供100μM KNO3的酵母甘露醇肉湯（YMB）中進行體內(nèi)測試。（B）在提供500μM KNO的YMB中進行體內(nèi)測試。僅對缺乏nosZ基因的日本慢生根瘤菌檢測不到N2O，而未檢測到攜帶nosZ基因的慢生根瘤菌。

圖4、評估Calonectria ilicicola對結(jié)節(jié)健康和N2O含量的影響。Bd：慢生根瘤菌，Bj：慢生型大豆根瘤菌，Ci：Calonectria ilicicola.（A）C.ilicicola對大豆根腐病的影響。（B）C.ilicicola對根瘤大小的影響。（C）C.ilicicola對根瘤重量的影響。（D）C.ilicicola對根瘤數(shù)量的影響。（E）C.ilicicola對根瘤中N2O含量的影響。（F）C.ilicicola對酵母甘露醇肉湯（YMB）中根瘤和Bd中nosZ相對表達的影響

圖5、Bradyrhizobium屬特異性引物和四種物種特異性引物的開發(fā)。（A）凝膠電泳，交叉驗證Bd、Bj、Be和Bl特異性PCR產(chǎn)物的特異性。（B）凝膠電泳以交叉驗證Bradyrhizobium屬特異性PCR產(chǎn)物的特異性。（C）qPCR反應(yīng)中Bd特異性引物的熔解峰。（D）qPCR反應(yīng)中Be特異性引物的熔解峰。（E）qPCR反應(yīng)中Bj特異性引物的熔解峰。（F）qPCR反應(yīng)中Bl特異性引物的熔解峰。（G）qPCR反應(yīng)中Bradyrhizobium屬特異性引物的熔解峰。

結(jié)論與展望

氧化亞氮（N2O）的產(chǎn)生是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)凈零排放的重大挑戰(zhàn)，這主要是由于對氮肥的依賴。盡管氮肥滿足了生產(chǎn)富含蛋白質(zhì)種子的高氮需求，但大豆（Glycine max）也能與根瘤菌形成根瘤以促進生物固氮。然而，某些根瘤菌可以進行反硝化作用，這一過程將NO??還原為N?。如果反硝化的最后一步由一氧化二氮還原酶（由nosZ基因編碼）介導(dǎo)——被破壞，N2O將被產(chǎn)生，而不是N2。

研究表明由含有nosZ基因的Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110形成的根瘤比由缺乏nosZ基因的Bradyrhizobium japonicum USDA6形成的根瘤產(chǎn)生更少的水溶性N2O，突顯了nosZ基因在減少根瘤中N2O含量中的關(guān)鍵作用。

此外，接種真菌病原體Calonectria ilicicola會減少B.diazoefficiens的根瘤生物量和nosZ基因表達，導(dǎo)致根瘤中N?O含量增加。然而當大豆根瘤中存在nosZ基因時，C.ilicicola引起的N?O含量增加變得無關(guān)緊要。因此研究人員進行了田間調(diào)查以揭示nosZ基因的區(qū)域分布情況。Unisense 氧化亞氮微電極在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵用，通過高精度的N2O檢測，為研究根瘤菌和土壤真菌病原體對大豆根瘤中N2O含量的影響提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

該設(shè)備的高靈敏度和精確度使得研究人員能夠準確評估不同條件下N2O的產(chǎn)生情況，為理解農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中N2O的產(chǎn)生機制提供了重要的實驗依據(jù)。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了使用含有nosZ基因的根瘤菌菌株以促進可持續(xù)大豆生產(chǎn)的重要性，這比控制土傳病原體如C.ilicicola更為重要，以減少N2O的產(chǎn)生，同時綜合考慮細菌和真菌的影響將支持可持續(xù)農(nóng)業(yè)實踐的凈零目標。